双特异抗原嵌合受体修饰的CAR-T细胞在前列腺癌中治疗的应用研究

需要解决的问题:

1.通过对病理切片进行免疫组化筛查，包括PSMA，ROR-1，PSMA-PDL1, CYR61, PSCA, LewisY, EGFR抗原等，确定一个或几个前列腺癌特异性抗原。

2. 构建靶向上述特异性的嵌合混合抗原受体(如PSMA-PDL1-CAR)的逆转录病毒载体pLNCX-PSMA-PDL1.CAR及携带luciferase的逆转录病毒载体pLNCX-LUC2，并采用逆转录病毒包装试剂盒包装出相应的病毒。

3. pLNCX-LUC2病毒感染Hela、Huh7、PC3、LNCaP等肿瘤细胞，并筛选稳定表达LUC2细胞株；pLNCX-PSMA-PDL1.CAR病毒感染T细胞，并筛选稳定表达PSMA-PDL1细胞株，于用后续实验。

4. Luciferase生物发光检测人外周血淋巴细胞（CAR-T）对PSMA阳性肿瘤细胞的体外杀伤作用。

5. 将pLNCX-LUC2病毒稳定细胞株荷瘤祼鼠，并用人外周血淋巴细胞（PBL-CAR）对肿瘤生长的体内抑制作用，或用PC3在祼鼠的人工肺转移模型来检测PBL-CAR对肿瘤转移能力的抑制作用。 

计划达到的目标：

1.确定一个或多个前列腺癌特异性抗原，并将其构建成特异性识别的嵌合抗原受体（CAR），为下一步开发CAR-T细胞提供基础。

2. 明确嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞对前列腺癌细胞具有的靶向性、杀伤活性，并进行动物实验，为CAR-T细胞用于前列腺癌临床研究提供有利条件。 

双特异抗原嵌合受体修饰的CAR-T细胞在前列腺癌中治疗的应用研究

        前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)危及中老年男性生命健康。Siefel等2015年发表在CA Cancer J Clin杂志的数据显示，2015年内，PCa发病率在美国高达26%，位居癌症发病率首位，死亡率以9%排名第二。我国前列腺癌发病率虽低于欧美国家，但近年随着人口老龄化、生活习惯的改变以及体格检查的逐渐普及，前列腺癌的发病率也呈上升趋势，已位居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第3位。前列腺癌发病隐匿，发展至中晚期，易发生转移、耐药等棘手问题，严重影响患者生活质量和寿命。早期发现前列腺癌并治疗，具有重要意义。雄激素去势或是在雄激素受体水平阻断雄激素而进行的内分泌治疗是晚期前列腺癌的标准治疗方案。但是，80％-90％的晚期前列腺癌患者在接受内分泌治疗12-18个月后都从雄激素依赖会转变为侵袭性更强的激素非依赖型前列腺癌，即对雄性去势治疗后复发而形成的雄激素抵抗前列腺癌。一旦肿瘤呈现出激素非依赖特性，将对所有化疗药物产生高度耐药性，也对任何其他进一步的治疗方法效果均较差。因此，更强有效的靶向治疗成为下一种应对前列腺癌的必然选择。嵌合型抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）是由抗体源性靶向区与T 细胞信号区融合而成，当T细胞表达CARs后赋予T细胞抗原特异性，因而靶向结合并杀死肿瘤细胞。目前，在B细胞源性肿瘤中CAR-T 细胞治疗取得了较好的疗效，理论上CAR-T细胞在实体瘤中同样能发挥作用，但需要进一步的探索和改进。

然而CAR-T细胞实体瘤治疗面临三个主要挑战：

（1）缺乏合适的特异性肿瘤相关抗原

（2）CAR-T细胞不容易富集在肿瘤区域

（3）肿瘤微环境对CAR-T细胞的免疫抑制性

       CAR-T细胞治疗策略在血液肿瘤中能取得理想的效果，很重要的一个原因是血液肿瘤存在特异性的靶点，如B细胞血液恶性肿瘤中CD19的表达几乎达到100%，而实体瘤中很难找到像血液肿瘤那样的特异性抗原；大部分抗原在肿瘤细胞上都是相对高表达，正常细胞也会有少量的表达，因此很难避免对正常细胞的非特异性杀伤。异质性是实体肿瘤更为突出的特点之一，这也意味着即使是同一位患者一个部位的肿瘤也并非均表达相同的肿瘤相关性抗原。即使在一个肿瘤病灶上，无一种靶抗原可以覆盖全部的肿瘤细胞。如果只用一种单靶点的CAR-T细胞治疗实体肿瘤，那么理论上实体瘤高度异质性的特点就决定了其必然会复发或无法根除。因此，肿瘤特异性抗原的选择是CAR-T治疗实体瘤的最大瓶颈。