cfDNA和CTC联合监控肺癌治疗的临床应用研究

1.拥有生物学实验室和PCR实验室

2．已开展循环肿瘤细胞（CTC）的项目

3.拥有经验丰富、操作熟练、具有上岗资格证的技术人员

1不同分期肺癌患者CTC和cfDNA两种检测方法评估治疗疗效的预测模型建立； 2建立标准化的检测流程和结果判读标准。

通过CTC和cfDNA检测，评估两种检测方法单独和联合监控肺癌治疗的价值：

1) 阐明CTC和cfDNA检测与肺癌治疗疗效的相关性，建立预测模型；

2) 发表SCI论文1-2篇。后续成果作为前期基础继续申报课题。

细胞游离DNA片段（cfDNA）检测是近年来新兴的、发展较快的一种“液体活检”技术。研究发现，癌症患者血浆和血清中cfDNA异常增高[1]，提示cfDNA与肿瘤具有相关性，并有可能成为评价预后和监测疗效的生物标志物[2]。至今，已在结直肠癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤中，发现cfDNA具有特征性基因改变，包括点突变、微卫星不稳定、DNA超甲基化、杂合子缺失等[3]。多项研究表明，cfDNA的基因改变与原发肿瘤及循环肿瘤细胞（CTC）基因改变具有高度一致性[4, 5]。CTC或循环肿瘤细胞DNA（ctDNA）可

细胞游离DNA片段（cfDNA）检测是近年来新兴的、发展较快的一种“液体活检”技术。研究发现，癌症患者血浆和血清中cfDNA异常增高[1]，提示cfDNA与肿瘤具有相关性，并有可能成为评价预后和监测疗效的生物标志物[2]。至今，已在结直肠癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤中，发现cfDNA具有特征性基因改变，包括点突变、微卫星不稳定、DNA超甲基化、杂合子缺失等[3]。多项研究表明，cfDNA的基因改变与原发肿瘤及循环肿瘤细胞（CTC）基因改变具有高度一致性[4, 5]。CTC或循环肿瘤细胞DNA（ctDNA）可作为肿瘤诊断、治疗和预后评估的新型生物标志物[6]，但在患者外周血中含量较低，不易提取和鉴定，由于其操作复杂，成本较高，且监测周期长，限制了其在临床中的实际应用[7]。有前期数据表明，cfDNA与ctDNA含量具有很强的正相关性[8]。因此，我们可以通过检测cfDNA的水平来间接监测肿瘤对治疗的反应。另外，正常组织或细胞在经受照射后也会发生凋亡或坏死，短时间内释放大量cfDNA，其变化量可提示放射损伤风险[9]。

如何高灵敏度，准确快速、便捷高效地检测血液中cfDNA含量变化是发展这一“液体活检技术”临床应用的关键，我们的合作研究单位开发出了一套核酸信号放大技术（SuperbDNATM），通过检测血中游离的Alu序列含量来间接反映cfDNA的总体水平。Alu序列是一段大量表达的重复序列，约占基因组的10%[10]，并在全血中稳定存在[11]，其表达与总cfDNA的水平具有很强的相关性[12]。

此技术平台用于量化cfDNA的敏感性达91.7%，特异性为88.6%[13, 14]，获得了美国全球专利（专利号US 2012/0003625 A1）。此技术平台特点是使用经过修饰的Branched DNA（bDNA）分子和新的探针组设计，提高靶DNA序列上的标记化学信号扩增，而不需扩增靶序列本身（如图1所示）。工作原理如下：每个寡核苷酸探针组含有两种类型的合成探针，即捕获延伸探针(CEs)和标记延伸探针(LEs)。CEs和LEs 都可以跟靶DNA序列结合。首先， MagPlex™ Microspheres（磁珠）偶联的捕获探针通过CEs-捕获探针以及CEs-靶DNA之间的共同杂交，捕获靶DNA序列。然后，LEs能够同时与靶DNA和预扩增探针结合。1个预扩增探针含有20个与扩增探针结合的位点，1个扩增探针也含有20个与标记探针结合的位点。因此，靶信号最终被放大400倍。最后，生物素标记探针与藻红蛋白标记的链霉亲和素（SAPE）结合，通过Luminex仪器如MAGPIX测出磁珠上的荧光强度。荧光强度与样品中存在的DNA分子数量成正比，即可推算出样品中cfDNA的水平。此方法实现了对血浆样本中cfDNA浓度的高灵敏定量检测，优点包括无需提取，无需扩增，易操作，检测周期短，适于临床检测需求。Canales等学者通过对比发现，SuperbDNATM比PCR在检测244个常见基因时显示出一定优势，如偏差更小；省去DNA提取丢失及扩增带来的误差影响；避免样品交叉污染；易于实现自动化及批量检测[15]。这一技术为我们在肿瘤治疗过程中监测cfDNA变化提供了必要的技术支持。